ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TERPENOID PADA BIJI PEPAYA

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TERPENOID PADA BIJI PEPAYA

Isolasi adalah proses pemisahan komponen – komponen kimia yang terdapat suatu bahan organisme . isolasi terdiri dari pemisahan , pemurnian , identifikasi dan penetapan . salah satu cara isolasi umum digunakan adalah kromatografi . pemisahan dari kromatografi ini didasarkan pada sifat adsorbsi atau partisi dari senyawa yang dipisahkan terhadap adsorben dan cairan pengulasi .

MATERI DAN METODE

Bahan

Biji pepaya yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji pepaya yang berwarna putih yang diambil di daerah Kupang-NTT. Bahan kimia yang digunakan seperti metanol (teknis dan p.a), kloroform p.a, n-heksana (p.a dan teknis), asam sulfat pekat, asam asetat anhidrat, kalium bromida (KBr), silika gel GF254, silika gel 60, etilasetat p.a, eter p.a, etanol (p.a dan teknis), dan akuades.

Peralatan

Peralatan yang digunakan adalah berbagai alat gelas, seperangkat alat kromatografi (KLT dan kolom), lampu ulta violet 254 nm dan 366 nm, spektrofotometer ultra violet -tampak, serta spektrofotometer inframerah.

Cara Kerja

Biji pepaya yang berwarna putih dicelupkan ke dalam etanol panas kemudian dikeringkan dan dihaluskan. Sebanyak 500 g serbuk kering biji pepaya diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksana. Ekstrak yang didapat diuapkan dengan rotary vacuum evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana. Ekstrak kental tersebut diuji fitokimia dengan pereaksi Liebermann-Burchard untuk menentukan ada tidaknya triterpenoid. Ekstrak kental positif triterpenoid dipisahkan dengan kromatografi kolom. Sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom, terlebih dahulu dilakukan pemilihan eluen dengan teknik KLT. Hasil pemisahan kromatografi kolom (silika gel 60, n-heksana : eter : etilasetat : etanol (2:3:3:2)) yang sama digabungkan dan dikelompokkan menjadi kelompok fraksi. Masing-masing kelompok fraksi tersebut diuji untuk triterpenoid. Fraksi yang positif mengandung triterpenoid dengan noda tunggal dilanjutkan dengan uji kemurnian secara KLT dengan beberapa campuran eluen. Bila tetap menghasilkan satu noda maka fraksi tersebut dapat dikatakan sebagai isolat relatif murni secara KLT. Isolat relatif murni ini kemudian dianalisis dengan Spektrofotometer Ultra violet­tampak dan Inframerah.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolat yang diperoleh sebanyak 50 mg dari sekitar 500 g sampel serbuk kering biji papaya. Pemisahan 21,66 g ekstrak kental n­heksana menggunakan kromatografi kolom (silika gel 60, n-heksana : eter : etilasetat : etanol (2:3:3:2)) menghasilkan 127 eluat, yang kemudian difraksinasi denagn KLT menghasilkan 3 kelompok fraksi. Ketiga kelompok fraksi tersebut diuji untuk triterpenoid dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Hasil uji triterpenoid ketiga kelompok fraksi tersebut dipaparkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil uji triterpenoid

Fraksi	Berat (gr)	Pereaksi LB
F1 (5-23)	0.10	Coklat
F2 (24-65)	1.22	Merah Ungu
F3 (66-127)	0.05	Merah Ungu

Fraksi yang dilanjutkan untuk analisis lebih lanjut adalah fraksi F3. Uji kemurnian dengan analisis KLT menggunakan beberapa fase gerak menghasilkan isolat relatif murni dengan satu noda pada berbagai polaritas eluen yang digunakan. Hasil analisis dengan spektrofotometri inframerah menunjukkan adanya serapan tajam pada daerah bilangan gelombang 2923,8 cm^-1 dan 2852,2 cm^-1 yang diduga serapan dari gugus C-H alifatik stretching. Dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 1464,4 cm^-1 dan 1206,5 cm^-1 yang merupakan serapan dari -CH2 dan –CH3 bending. Pita serapan yang tajam pada daerah bilangan gelombang 1710,4 cm^-1 dengan intensitas kuat mengidentifikasikan gugus karbonil (C=O) (Sastrohamidjojo, 1985). Identifikasi dengan spektrofotometri ultra violet -tampak menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 228,5 nm yang kemungkinan diakibatkan oleh terjadinya transisi elektrón n-0 ^* dari kromofor C=O. Hal ini didukung hasil analisis spektrofotometri inframerah yang menunjukkan isolat mempunyai gugus fungsi C=O pada panjang gelombang 1710,4 nm. Serapan ultra violet yang landai pada panjang gelombang 287,7 nm kemungkinan diakibatkan oleh terjadinya transisi elektronik n -J ^* dari ikatan rangkap C=O (Sastrohamidjojo, 1985).

Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa isolat triterpenoid (F3) dengan konsentrasi 1000 ppm memiliki potensi menghambat pertumbuhan bakteri dengan diameter daerah hambat sebesar 10 mm untuk bakteri E. coli dan 7 mm untuk bakteri S. aureus.

TERPENOID

TERPENOID

Terpenoid merupakan bentuk senyawa dengan keragaman struktur yang besar dalam produk alami yang diturunkan dari unit isoprena (C5) yang bergandengan dalam model kepala ke ekor (head-to-tail), sedangkan unit isoprena diturunkan dari metabolisme asam asetat oleh jalur asam mevalonat (mevalonic acid : MVA).

Senyawa umum biosintesa terpenoid dengan terjadinya 3 reaksi dasar, yaitu:

1.     Pembentukan isoprene aktif  berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat.

2.     Penggabungan senyawa dan ekor dua unit isopren akan membentuk mono-, seskui-, di-, sester-, dan poli-terpenoid.

3.     Pengabungan ekor dan ekor dari unit C15 atau C20 menghasilkan terpenoid atau steroid.

Perbandingan banyaknya atom karbon dan atom hydrogen dalam terpen adalah 5 : 8. Terpen tersusun dari senyawa – senyawa yang mengandung gabungan kepala ke ekor dari satuan kerangka isoprene (kepala adalah ujung yang terdekat ke cabang metil). Untuk menekankan hubungan dengan isoprene ini maka terpen juga disebut isoprenoid.terpan mengandung 2,3 atau lebih satuan isoprene.

Secara umum terpenoid terdiri dari unsur-unsur C dan H dengan rumus molekul umum (C₅H₈)_n. Struktur terpenoid yang bermacam ragam timbul akibat dari reaksi sekunder berikutnya seperti hidrolisa, isomerisasi, oksidasi, reduksi dan siklisasi atas geranil, farnesil, dan geranil-geranil pirofosfat.

Klasifikasi biasanya tergantung pada nilai n.

Nama	Rumus	Sumber
Monoterpen	C10H16	Minyak Atsiri
Seskuiterpen	C15H24	Minyak Atsiri
Diterpen	C20H32	Resin Pinus
Triterpen	C30H48	Saponin, Damar
Tetraterpen	C40H64	Pigmen, Karoten
Politerpen	(C5H8)n  n  8	Karet Alam

Klasifikasi dan struktur terpena dan terpenoid

Terpena memiliki rumus dasar (C₅H₈)n, dengan n merupakan penentu kelompok tipe terpena. Modifikasi terpena (terpenoid) adalah senyawa dengan struktur serupa tetapi tidak dapat dinyatakan dengan rumus dasar. Kedua golongan ini menyusun banyak minyak atsiri.

Tipe terpena dan terpenoid

v Hemiterpena, n=1, hanya isoprena.

v Hemiterpenoid, contohnya prenol, asam isovalerat.

Isoprena terdapat langka dalam tumbuhan tetapi memang terdapat dalam dedaunan. Contoh lain dari hemiterpenoid ini adalah iso-amilalkohol, iso valeraldelhida, asam senesioat, asam tiglat, asam angelat dan asam β-furoat.

v Monoterpena, n=2, contohnya mircen, limonen, dan ocimen.

v Monoterpenoid, contohnya geraniol.

Monoterpenoid terbentuk dari dua satuan isoprena dan biasanya mempunyai sepuluh atom karbon. Monoterpenoid merupakan komponen utama banyak minyak atsiri dan mempunyai makna ekonomi besar sebagai bau-rasa, wewangian dan pelarut. Monoterpenoid khas berupa cairan tak berwarna, tidak larut dalam air, dapat disuling uap dan berbau harum. Contoh monoterpenoid lain seperti mirsena, lavandol, geranial, keton artemisia, perinia, α-felandrena, pulegon, menton, mentofuran, mentol, 1,8 sinesol, eukarvon, kripton, safranal, nepelakton, askaridol dan lain-lain.

v Seskuiterpena, n=3, contohnya farnesen.

v Seskuiterpenoid, contohnya farnesol, kurkumen, bisabolol.

Seskuiterpenoid adalah senyawa C15 biasanya dianggap berasal dar i tiga satuan isoprena. Seperti monoterpenoid, seskuiterpenoid terdapat sebagai komponen minyak atsiri yang tersuling uap dan berperan penting dalam aroma kepada buah dan bunga. Kegunaan kaidah isoprena secara umum dan kadang-kadang kekecualian yang disebutkan terdahulu berlaku juga untuk golongan ini. Anggota seskuiterpenoid asiklik ialah farnesol dengan alkohol yang tersebar luas. Farnesol pirofosfat merupakan senyawa antara kunci dalam biosintesis terpenoid. Sebagian besar seskuiterpenoid monosiklik mempunyai kerangka farnesol yang tertutup membentuk cincin anggota 6. Contoh seskuiterpenoid yaitu γ-bisabolena, zingiberena, lanseol, ar-turmeron, perezon dan asam (S)-absisat.

Salah satu seskuiterpenoid monosiklik terpenting adalah asam absisat, hormon yang melawan efek giberelin dan menghambat pertumbuhan kuncup. Sejumlah senyawa C13 berasal dari seskuiterpenoid telah diketahui penyebabnya bermakna bau-rasa buah. Banyak senyawa seskuiterpenoid yang diketahui mempunyai efek fisiologi terhadap hewan dan tumbuhan. Sementara beberapa senyawa seskuiterpenoid ada yang mengandung gugus fungsi lakton yang beracun yang merupakan kandungan tumbuhan obat. Senyawa lain bekerja sebagai penolak serangga dan insektisida, bebeapa merangsang pertumbuhan tumbuhan, dan bekerja sebagai fungisida.
 Selain gugus fungsi lakton juga terdapat dua gugus aldehida yang dipisahkan oleh 2 atom karbon. Gugus dialdehida ini menyebabkan beberapa tumbuhan pedas dan juga aktif sebagai penolak serangga.

Contoh seskuiterpenoid monosiklik biasa adalah humulen, zerumbon, elemol dan nootkatin. Seskuiterpenoid bisiklik seperti α-kadinena, guaiol, β-selinena, eudesmol, santonin, kesil alkohol, vetivon dan artabsin. Seskuiterpenoid tidak biasa seperti iresin, karyofilena, eremofilon, akoron, sedrol, kuparena, tujopsena.

v Diterpena, n=4, contohnya cembren.

v Diterpenoid, contohnya kafestol.

Diterpenoid merupakan senyawa C20 yang berasal dari empat satuan isoprenoid. Karena titik didihnya yang tinggi biasanya diterpenoid tidak ditemukan dalam minyak atisri tumbuhan meskipun diterpenoid bertitik didih rendah pun. Senyawa ini ditemukan dalam damar, eksudat berupa gom dan dalam fraksi bertitik didih tinggi seperti damar yang tersisa setelah penyulingan minyak atsiri. Misalnya, rosin yang tersisa setelah penyulingan terpentin pinus kaya akan diterpenoid.
Diterpenoid mencakup beberapa senyawa dari segi fisiologi sangat menarik seperti golongan hormon tumbuhan yang dikenal sebagai giberelin. Seperti seskuiterpenoid, diterpenoid mencakup banyak senyawa yang bekerja sebagai fungisida, racun terhadap hewan, penolak serangga dan sebagainya. Senyawa ini dapat bersifat karsinogen. Beberapa senyawa ini mempunyai efek racun atau efek penolakan terhadap serangga sementara senyawa lainnya menarik serangga. Beberapa senyawa mempunyai aktivitas antivirus, sebagai fungisida dan pembentukannya disulut oleh infeksi fungus. Satu senyawa dari kemangi mempunyai aktivitas hormon remaja. Forskolin dari Coleus forskohli merupakan pengaktif khas adenilat siklase. Partenolida dari parthenum tanacetum berguna untuk mengobati migrain karena menghambat pelepasan serotonin.

Contoh senyawa diterpenoid adalah fitol, asam giberelat, α-kamforena, (-)-kaurena, asam dekstro-pimarat, marubin, asam abietat

v Triterpena, n=6, contohnya skualena.

v Triterpenoid, contohnya lanosterol, bahan dasar bagi senyawa-senyawa steroid. 

                        Triterpenoid memiliki atom C30. triterpenoid tersebar luas dalam damar, gabus dan kutin tumbuhan. Damar adalah asam triterpenoid yang sering bersama-sama dengan gom polisakarida dalam damar gom. Triterpenoid alkohol juga terdapat bebas dan sebagai glikosida. Triterpenoid asiklik yang penting hanya hidrokarbon skualena yang diisolasi untuk pertama kali dari minyak hati ikan hiu tetapi juga ditemukan dalam beberapa malam epikutikula dan minyak nabati (minyak zaitun). Senyawa triterpenoid yang paling dikenal seperti lanosterol yang terdapat dalam lemak wol, khamir dan beberapa senyawa tumbuhan tinggi. Triterpenoid tetrasiklik seperti alkohol eufol dari euphorbia sp dan asam elemi dari canarium commune. Triterpenoid yang terpenting ialah triterpenoid pentasiklik. Senyawa ini ditemukan dalam tumbuhan seprimitif sphagnum tetapi yang paling umum adalah pada tumbuhan berbiji, bebas dan glikosida. Triterpenoid nonglikosida sering ditemukan sebagai ekskresi dan dalam kutikula bekerja sebagai pelindung atau menimbulkan ketahanan terhadap air. Beberapa macam aktivitas fisiologi dari triterpenoid yang merupakan komponen aktif dari tumbuhan telah digunakan sebagai tumbuhan obat untk penyakit diabetes, gangguan menstruasi, patukan ular, gangguan kulit, kerusakan hati dan malaria.

v Tetraterpena, n=8, contohnya adalah likopen, karoten

v Tetraterpenoid
Tetraterpenoid yang paling dikenal adalah karotenoid-pigmen larut dalam lemak berwarna kuning sampai merah terdapat pada semua tumbuhan dan dalam lemak berbagai jenis jaringan. Pigmen hidrokarbon disebut karoten dan turunannya yang teroksigenasi disebut xantofil. Dikenal juga tetraterpenoid tanwarna yaitu fitoena dan fitofluena. Karotenoid sebagai reseptor cahaya untuk fototropisme. Sebagai pigmen bunga karotenoid mungkin berperan dalam menarik serangga tetapi sebagian besar perhatian dicurahkan pada fungsinya sebagai pigmen daun. Senyawa ini terdapat pada kloroplas dan terikat secara longgar pada protein.Karotenoid yang paling tersebar luas adalah β-karoten.

v Politerpena, n besar, contohnya adalah karet dan getah perca.

Permaslahannya : Mengapa senyawa terpena tidak sama dengan senyawa terpenoid, padahal sama-sama tersusun dengan senyawa yang sama??