PENENTUAN STRUKTUR TERPENOID

METODE

Penentuan spektroskopi inframerah (IR) suatu senyawa hasil isolasi diukur dengan menggunakan alat spektrometer Buck Scientific M500. Spektrum 1H dan 13C NMR diukur dengan menggunakan spektrometer JEOL JNM-ECA500 NMR, beroperasi pada 500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C), menggunakan pelarut sebagai standar internal. Kromatografi cair vakum (KCV) dilakukan dengan menggunakan Si Gel Merck 60 GF254, kromatografi kolom gravitasi (KKG) dengan Si Gel Merck 60 (60 – 70 mesh), dan analisis kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan pelat berlapis Si Gel Merck Kieselgel 60 F254, 0,25 mm.

Pengumpulan bahan tumbuhan.

Bahan berupa kulit batang tumbuhan kedoya dikumpulkan pada bulan Juni 2007 dari Kebun Raya Purwodadi. Tumbuhan ini telah diidentifikasi oleh staf Herbarium LIPI, Purwodadi, Pasuruan dan spesimennya disimpan di Herbarium tersebut.

Ekstraksi dan isolasi.

Kulit batang tumbuhan kedoya yang telah dikeringkan dan digiling halus (3 kg), kemudian diekstraksi dengan pelarut heksana sebanyak 3 kali. Setelah pelarut diuapkan dari ekstrak heksana pada tekanan rendah, diperoleh residu berwarna kuning kehijauan masing-masing 17,07 g; 9,01 g, dan 5,03 g (berat total ekstrak heksana sebesar 31,114 g). Ekstrak heksana sebanyak 31,114 g ini dibagi menjadi 3 bagian dengan berat masing-masing bagian kurang lebih 10; 10; dan 11,1 g (selanjutnya disebut fraksi utama I, II, dan III). Kemudian, masing-masing fraksi utama ini difraksinasi melalui kromatogafi cair vakum (KCV) berturut-turut menggunakan eluen campuran heksana-etil asetat (10/0, 9/1, 8/2, 5/5. 3/7, dan 0/10), masing-masing menghasilkan 34 fraksi. Dari 34 fraksi dari masing-masing fraksi utama ini digabung menjadi 6 fraksi gabungan dan selanjutnya disebut fraksi A (5,231 g), B (8,669 g), C (7,400 g), D (1,277 g), E (4,297 g), dan F (3,6 g).

Pemisahan berikutnya dilakukan terhadap fraksi gabungan C (7,400 g) dengan menggunakan cara dan eluen yang sama di atas, dihasilkan 18 fraksi serta digabung menjadi 5 fraksi, yaitu C1 (1 – 6), C2 (7 – 9; 6,900 g), C3 (10 – 11), C4 (12 – 17), dan C5 (18 – 28). Terhadap fraksi C3 (10 – 11) dipisahkan melalui KKG dengan eluen campuran heksana/etil asetat (95/5) dan diperoleh 74 fraksi. Atas dasar analisis KLT, ke-74 fraksi tersebut digabung menjadi 4 fraksi, yaitu fraksi C3a (1 – 10), C3b (11 – 42), C3c (43 – 62), dan C3d (63 – 74). Hasil evaporasi terhadap fraksi C3b (11 – 42) diperoleh 1,596 g dan dilanjutkan untuk dipisahkan dengan menggunakan cara dan eluen yang sama di atas dihasilkan 66 fraksi. Dari 66 fraksi ini, atas dasar analisis KLT diperoleh 2 fraksi gabungan besar, yaitu fraksi C3b1 (1 – 60) dan C3b2 (61 – 66).

Penguapan fraksi C3b1 diikuti terbentuknya suatu kristal putih dan selanjutnya direkristalisasi secara berulang-ulang dalam pelarut metanol panas, diperoleh kristal murni seberat 51 mg (disebut isolat 1). Karakterisasi berikutnya dilakukan terhadap isolat ini melalui pengukuran spektroskopi IR dan NMR.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Data spektroskopi senyawa hasil isolasi (isolat 1) adalah sebagai berikut. Spektrum IR (KBr) senyawa hasil isolasi menunjukkan serapan ν maks. pada 3429 (-OH), 2936 – 2861 (CH alifatik), 1462 (C=C siklik), 1375 (-CH(CH3)2), dan 1056 cm-1. Memperhatikan pola dan jumlah sinyal pada spektrum NMR senyawa hasil isolasi diduga mengandung dua isomer dan disebut senyawa a dan senyawa b. Spektrum 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) senyawa a memperlihatkan sejumlah sinyal pada δC 140,9 (C-5), 121,9 (C-6), 71,9 (C-3-OH), 56,9 (C-14), 56,1 (C-17), 50,3 (C-9), 46,0 (C-24), 42,5 (C-4), 42,5 (C-13), 39,8 (C-12), 37,4 (C-1), 36,7 (C-10), 36,3 (C-20), 34,1 (C-22), 32,1 (C-7), 32,1 (C-8), 31,8 (C-2), 29,3 (C-25), 28,4 (C-16), 26,2 (C-23), 24,5 (C-15), 23,2 (C-241), 20,2 (C-11), 20,0 (C-19), 20,0 (C-26), 19,2 (C-27), 18,9 (C-21), dan 12,0 (C-242) ppm. Spektrum 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) senyawa b juga memperlihatkan sejumlah sinyal pada δC 140,9 (C-5), 138,5 (C-22), 129,4 (C-23), 121,9 (C-6), 71,9 (C-3-OH), 57,0 (C-14), 56,2 (C-17), 51,4 (C-240, 50,3 (C-9), 42,5 (C-4), 42,4 (C-13), 39,9 (C-12), 40,7 (C-20), 37,4 (C-1), 36,7 (C-10), 32,1 (C-7), 32,1 (C-8), 31,8 (C-2), 31,8 (C-25), 29,1 (C-16), 24,6 (C-241), 24,5 (C-15), 21,3 (C-21), 21,3 (C-26), 20,2 (C-11), 19,6 (C-19), 19,2 (C-27), 12,2 (C-18), dan 12,2 (C-242) ppm.

Disisi lain, residu dari serbuk kulit batang tumbuhan kedoya dimaserasi ke dalam pelarut metanol sebanyak 3 kali, kemudian dievaporasi pada tekanan rendah dan diperoleh ekstrak kental berwarna hijau tua (71,5 g). Selanjutnya, ekstrak kental metanol ini kembali dilarutkan dalam sedikit pelarut metanol, untuk selanjutnya dipartisi dengan kloroform sebanyak 3 kali pula. Setelah pelarut diuapkan dari porsi/bagian kloroform pada tekanan rendah, diperoleh ekstrak kloroform kental berupa residu berwarna hijau tua (30,7 g). Seluruh ekstrak kloroform ini difraksinasi sebanyak 3 kali dengan berat bagian masing-masing kurang lebih 10 g melalui KVC dengan menggunakan eluen yang sama, yaitu heksana, campuran heksana – kloroform, heksana – kloroform – metanol, dan metanol dengan tingkat kepolaran yang terus meningkat, masing-masing menghasilkan 22, 34, dan 18 fraksi. Penggabungan fraksi-fraksi tersebut atas dasar analisis KLT menghasilkan 4 fraksi utama, yaitu fraksi A (2,123 g), B (3,974 g), C (3,104 g), dan D. Pemisahan berikutnya dilakukan terhadap fraksi B (3,974 g) baik melalui cara/teknik KVC dan KKG menggunakan berbagai macam eluen yang sesuai diikuti proses rekristalisasi, dihasilkan suatu kristal putih sebanyak 20 mg (isolat 2). Uji karakterisasi berikutnya terhadap sampel kristal isolat tersebut meliputi uji spektroskopi IR dan NMR.

Data spektroskopi senyawa hasil isolasi adalah sebagai berikut. Spektrum IR (KBr) senyawa hasil isolasi (isolat 1) menunjukkan serapan ν maks. pada 3300,6 (-OH); 2936,0 (-CH); 1663,5 (-C=O); 1575,3; 1507,0; dan 1450,7 (-C=C); 1357,0 (-CH3); 1278,9 (=C-OH); 1216,7; 1160,4; dan 845,1 (1,4-disubstitusi benzena) cm-1. Spektrum 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) senyawa hasil isolasi memperlihatkan sejumlah sinyal pada δC 26,5 (1 CH3), 115,6 (2 -CH=), 131,3 (2 –CH=), 130,1 (1 –C=); 161,1 (1 –C-OH); dan 198,2 (-C=O) ppm. Pemisahan ekstrak kloroform kulit batang tumbuhan kedoya dihasilkan suatu senyawa hasil isolasi, yang diperoleh melalui beberapa tahap fraksinasi, diikuti oleh pemilihan fraksi utama berdasarkan analisis kromatogafi lapis tipis (KLT), pemurnian melalui kolom kromatografi dan rekristalisasi, serta pengukuran spektroskopi.

Suatu senyawa hasil isolasi (isolat 1) berupa kristal putih telah diperoleh dari kolom kromatografi dan rekristalisasi berulang-ulang dalam pelarut metanol panas. Dengan pereaksi Lieberman-Burchard, senyawa ini memberikan warna ungu, namun tidak memberikan pendar dibawah lampu UV baik pada panjang gelombang 254 maupun 366 nm, berarti menunjukkan suatu senyawa triterpen jenis steroid. Spektrum IR senyawa hasil isolasi ini (Gambar 1) memperlihatkan serapan pada daerah 3429, 2936 – 2861, 1462, 1375, dan 1056 cm-1 yang masing-masing menunjukkan vibrasi ulur –OH, vibrasi ulur –CH3, –CH2 dan -CH, vibrasi ikatan rangkap (C=C), vibrasi tekuk C-H dan vibrasi tekuk dari dimetil geminal [-C(CH3)2], dan vibrasi ulur C – O (Silverstein, 1981). Data dan pola serapan spektrum IR ini sebagaimana terlihat pada Gambar 1 mendukung bahwa senyawa hasil isolasi adalah suatu senyawa triterpen jenis steroid.

Gambar 1.

Gambar 2. Spektrum 13C- NMR dari Isolat 1 (Perbesaran).

Data spektrum 13C-NMR senyawa hasil isolasi (Gambar 2 ) memperlihatkan adanya 44 sinyal yang menunjukkan adanya 58 atom karbon, terdiri dari dua isomer (sebagai senyawa a dan senyawa b) dengan masing-masing senyawa mengandung 29 atom karbon. Berdasarkan data spektrum 13C-NMR senyawa hasil isolasi yang didukung oleh spektrum H-NMR (Gambar 3a dan 3b), HMQC (Gambar 4) dan DEPT-135, diketahui bahwa kedua senyawa a dan senyawa b memiliki 29 karbon yang terdiri dari 6 gugus metil (-CH3), 11 gugus metilen (-CH2-), 3 atom karbon kuaterner, dan 1 atom C-OH dengan masing-masing mengandung 8 dan 6 gugus metin (-CH-), (lihat Table 1).

Spektrum senyawa a memiliki 4 sinyal yang menggambarkan adanya 6 gugus metil, yang terletak pada daerah geseran kimia (δC ppm) 20,0 (2C); 19,2 (1C); 18,9 (1C); dan 12,0 (2C). Ada 11 buah gugus metilen (-CH2) yang mengarah kebawah (pada spectrum DEPT-135) masing-masing terletak pada daerah geseran kimia (δC ppm) 42,5; 39,8; 37,4; 34,1; 32,1; 31,8; 28,4; 26,2; 24,5; 23,2 dan 20,2. Pada geseran kimia (δC ppm) 29,3 – 56,9 terdapat 7 buah gugus metin (-CH), yaitu di daerah 29,3; 32,1; 36,3; 46,0; 50,3; 56,1; dan 56,9 serta 1 buah gugus metin ikatan rangkap (-CH=C-) pada 121,9. Spektrum ini juga menunjukkan adanya 2 buah gugus metun (karbon kuaterner, -C-) pada geseran kimia (δC ppm) 42,5 dan 36,7 dan 1 buah gugus metun ikatan rangkap (–C=) pada 140,8 ppm. Sementara itu, gugus karbinol (C-OH) ditunjukkan di daerah δC 71,9 ppm dan adanya gugus hidroksil ini didukung oleh spektrum IR dengan serapan pada 3429 cm-1. Analisis spektrum yang sama dilakukan pula untuk mengkarakterisasi senyawa b, sebagaimana terlihat pada Tabel 1 berikut. Diketahui bahwa ada sinyal pada spektrum 13C-NMR yang berbeda antara senyawa b dengan senyawa a, yaitu di daerah 138,5 dan 129,4 ppm, masing-masing menggambarkan adanya gugus –CH= untuk senyawa b dengan 34,1 (-CH2-) dan 26,2 ppm, masing-masing menggambarkan adanya gugus –CH2- untuk senyawa a. Dengan membandingkan data-data spektrum 13C-NMR antara senyawa a dan senyawa b dengan senyawa -sitosterol dan stigmasterol (Gambar 5), dapat disimpulkan bahwa senyawa a dan senyawa b adalah masing-masing -sitosterol dan stigmasterol. Sementara itu, spektrum IR senyawa isolat 2 (Gambar 6) memperlihatkan serapan pada daerah 3300,6; 2936,0; 1663,5; 1575,3; 1507,0; 1450,7; 1357,0; 1278,9; 1216,7; 1160,4; dan 845,1 cm-1. Data-data serapan IR ini masing-masing menunjukkan vibrasi ulur –OH (3300,6 cm-1), vibrasi ulur –CH (2936,0 cm-1), vibrasi ulur C=O (1663,5 cm-1), vibrasi ulur ikatan rangkap terkonjugasi dari benzena (C=C-C=C) (1575,3; 1507,0; dan 1450,7 cm-1), vibrasi tekuk C-H (1357,0 cm-1), dan vibrasi ulur C – O (1278,9 cm-1) (Silverstein, 1981).

Gambar 3. a) Spektrum 1H- NMR dari Isolat 1

Gambar 3.b) Spektrum 1H- NMR dari Isolat 1 (Perbesaran)

Tabel 1. Nilai geseran kimia dari spektrum C-NMR (δ ppm, CDCl3) dari senyawa -Sitosterol dan Stigmasterol [6] dengan senyawa a dan senyawa b.

No. C				13C- NMR ( ppm)				Jenis Karbon
-Sitosterol				Stigmasterol				Senyawa hasil isolasi
a						b
1		37,3		37,3		37,4		37,4		-CH2-
2		31,7		31,7		31,8		31,8		-CH2-
3		71,8		71,4		71,9		71,9		-C-OH
4		42,3		42,3		42,5		42,5		-CH2-
5		140,8		140,8		140,9		140,9		-C=
6		121,7		121,7		121,9		121,9		-CH=
7		32,1		32,1		32,1		32,1		-CH2-
8		31,9		31,9		32,1		32,1		-CH-
9		50,2		50,1		50,3		50,3		-CH-
10		36,5		36,5		36,7		36,7		-C-
11		20,2		20,2		20,2		20,2		-CH2-
12		39,8		39,1		39,8		39,9		-CH2-
13		42,3		42,3		42,5		42,4		-C-
14		56,8		56,9		56,9		57,0		-CH-
15		24,3		24,4		24,5		24,5		-CH2-
16		28,3		28,8		28,4		29,1		-CH2-
17		56,0		56,0		56,1		56,2		-CH-
18		11,9		12,1		12,0		12,2		-CH3
19		19,8		19,4		20,0		19,6		-CH3
20		36,2		40,5		36,3		40,7		-CH-
21		18,7		21,1		18,9		21,3		-CH3
22	34,0		138,3		34,1		138,5		-CH2-		-CH=
23	26,1		129,3		26,2		129,4		-CH2-		-CH=
24		45,8		51,3		46,0		51,4		-CH-
25		29,2		31,9		29,3		31,8		-CH-
26		19,8		21,2		20,0		21,3		-CH3
27		19,1		19,0		19,2		19,2		-CH3
241		23,1		25,4		23,2		24,6		-CH2-
242		12,0		12,3		12,0		12,2		-CH3

Gambar 4. Spektrum HMQC dari Isolat 1.

 

Gambar 6. Spektrum IR dari Isolat 2

Berdasarkan spektrum 13C-NMR senyawa isolat 2 (Gambar 7) yang didukung oleh spektrum HMQC, senyawa hasil isolasi ini memiliki 8 karbon yang terdiri dari 1 gugus metil (-CH3), 4 gugus metin (-CH-), dan 3 atom karbon kuaterner (-C=) (lihat Table 2). Spektrum senyawa hasil isolasi ini memiliki 6 sinyal yang menggambarkan adanya 1 gugus metil, yang terletak pada daerah geseran kimia (δC ppm) 26,5, empat (4) gugus metin (-CH=) terletak pada daerah geseran kimia (δC ppm) 115,6 (2 C) dan 131,3 (2 C), dan tiga (3) gugus metun (-C=) pada daerah geseran kimia 130,1; 161,1; dan 198,2 (-C=O).

Sementara itu, spektrum 1H-NMR senyawa isolat 2 (Gambar 8) memperlihatkan sejumlah sinyal proton yang menggambarkan adanya 1 gugus metil (-CH3) pada daerah 1,88 ppm, 1 gugus –OH fenol pada 6,93 ppm, 4 gugus metin (-CH=) di daerah 6,91 (2 H) dan 7,90 (2 H) ppm yang menjadi ciri dari turunan 1,4- disubstitusi benzena. Akhirnya, data spektroskopi ini mendukung bahwa senyawa isolat 2 diduga sebagai senyawa p-hidroksiasetofenon, seperti digambarkan pada Gambar 9.

Tabel 2. Nilai geseran kimia dari spektrum H- dan C-NMR (δ ppm, CDCl3) dari senyawa isolat 2

No. C	1H- NMR ( ppm)		13C- NMR ( ppm)		Jenis Karbon
1	-		161,1		=C-OH
2(6)	6,91 (d, J = 8,0 Hz)		115,6		-CH=
3(5)	7,90 (d, J = 8,0 Hz)		131,3		-CH=
4	-		130,1		-C=
7	-		198,2		-C=O
8	1,88 (s)		26,5		-CH3
=C-OH		6,93 (s)		-

KESIMPULAN

Penelitian kimia pada tumbuhan kedoya (Dysoxylum gaudichaudianum (A. Juss.) Miq.) telah dilakukan di laboratorium kami, dari penelitian ini telah ditemukan dua senyawa steroid, yaitu -sitosterol dan stigmasterol dan satu senyawa fenolik, p-hidroksiasetofenon. Sejauh ini, studi fitokimia terhadap tumbuhan dalam genus Dysoxylum belum pernah ditemukan senyawa fenolik tersebut. Untuk mengungkap lebih jauh senyawa-senyawa fenolik dan senyawa jenis lainnya guna mencari keragaman dan pola kimia senyawa-senyawa pada tumbuhan tersebut, kami masih terus melanjutkan kegiatan penelitian ini

Permasalahan :
1. Pada artikel diatas dapat disimpulkan bahwa dalam tumbuhan kedoya memiliki 2 senyawa terpenoid yaitu beta-sitosterol dan stigmasterol. Apakah bukti adanya senyawa tersebut didalam tumbuhan kedoya itu ?

2. Dalam artikel diatas disebutkan “Seluruh ekstrak kloroform ini difraksinasi sebanyak 3 kali dengan berat bagian masing-masing kurang lebih 10 g melalui KVC dengan menggunakan eluen yang sama, yaitu heksana, campuran heksana – kloroform, heksana – kloroform – metanol, dan metanol dengan tingkat kepolaran yang terus meningkat, masing-masing menghasilkan 22, 34, dan 18 fraksi. Penggabungan fraksi-fraksi tersebut atas dasar analisis KLT menghasilkan 4 fraksi utama, yaitu fraksi A (2,123 g), B (3,974 g), C (3,104 g), dan D.” Pertanyaannya adalah mengapa fraksi yang telah digabungkan menjadi 4 fraksi, padahal sebelumnya masing-masing memilki 22, 34, dan 18 fraksi. Factor apakah yang menjadi penggabungan fraksi tersebut?