PENENTUAN STRUKTUR ALKALOID PADA DAUN KESUM

Serbuk daun kesum sebanyak 1 kg dimaserasi menggunakan metanol hingga filtratnya jernih. Maserasi ini bertujuan untuk mengekstrak senyawa metabolit sekunder yang ada pada daun kesum. Pada proses maserasi diperoleh ekstrak kental metanol sebanyak 28,576 g berwarna hijau pekat kehitaman. Ekstrak kental metanol masih mengandung banyak senyawa kimia (multi compound) dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Senyawa-senyawa tersebut dapat dipisahkan secara partisi berdasarkan kemampuannya untuk terdistribusi diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Proses partisi dilakukan berulang-ulang dengan tujuan agar jumlah senyawa yang terpartisi optimal. Proses partisi daun kesum menggunakan beberapa pelarut organik dengan kepolaran yang semakin meningkat yaitu n-heksana dan etil asetat. Dari proses tersebut diperoleh fraksi etil asetat (6,799 g), n-heksana (11,573 g) dan fraksi metanol (2,648 g), ketiga fraksi tersebut kemudian diuji kandungan alkaloidnya menggunakan reagen Mayer dimana Adanya alkaloid ditunjukkan dengan munculnya endap-Serbuk daun kesum sebanyak 1 kg dimaserasi menggunakan metanol hingga filtratnya jernih. Maserasi ini bertujuan untuk mengekstrak senyawa metabolit sekunder yang ada pada daun kesum. Pada proses maserasi diperoleh ekstrak kental metanol sebanyak 28,576 g berwarna hijau pekat kehitaman.

Ekstrak kental metanol masih mengandung banyak senyawa kimia (multi compound) dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Senyawa-senyawa tersebut dapat dipisahkan secara partisi berdasarkan kemampuannya untuk terdistribusi diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Proses partisi dilakukan berulang-ulang dengan tujuan agar jumlah senyawa yang terpartisi optimal. Proses partisi daun kesum menggunakan beberapa pelarut organik dengan kepolaran yang semakin meningkat yaitu n-heksana dan etil asetat. Dari proses tersebut diperoleh fraksi etil asetat (6,799 g), n-heksana (11,573 g) dan fraksi metanol (2,648 g), ketiga fraksi tersebut kemudian diuji kandungan alkaloidnya menggunakan reagen Mayer dimana Adanya alkaloid ditunjukkan dengan munculnya endapan putih, kemudian endapan jingga dengan reagen Dragendroff dan endapan cokelat dengan reagen Wagner. Berdasarkan uji alkaloid terhadap fraksi metanol, n-heksana dan etil asetat diketahui bahwa fraksi metanol dan etil asetat menunjuk- kan hasil positif mengandung senyawa alkaloid. Sementara fraksi n-heksana memberi hasil negatif, hal ini dikarenakan senyawa alkaloid terdistribusi pada pelarut yang bersifat polar. Pada penelitian ini, fraksi yang dipilih untuk diteruskan tidak hanya berdasarkan hasil uji alkaloid saja. Faktor pertimbangan lainnya adalah berat fraksi. Hal ini disebabkan banyaknya tahapan pemisahan dan pemurnian yang harus dilakukan. Jika jumlah fraksi terlalu sedikit dikhawatirkan akan habis sebelum diperoleh isolat yang relatif murni. Berdasarkan pertimbangan tersebut, dipilih fraksi etil asetat yang diteruskan untuk dilakukan pemurnian dan pemisahan. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi vakum cair dan Kromatografi Kolom Tekan (KKT). Pada tahap awal Pemisahan dilakukan proses Kromatografi Vakum Cair (KVC) dengan eluen yang bergradien. Eluen yang digunakan dalam KVC merupakan eluen yang mampu mengelusi sampel. Pemilihan eluen dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Proses elusi pada KVC menggunakan beberapa sistem eluen yang meningkat kepolarannya. Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi kerja dan biaya. Penggunaan hanya satu sistem eluen akan menghabiskan volume eluen jauh lebih banyak untuk mengeluarkan seluruh komponen dari kolom silika gel. Dari hasil KVC diperoleh 5 fraksi gabungan (A-E), kemudian dilakukan uji alkaloid. Berdasarkan uji alkaloid tersebut maka fraksi B dipilih untuk diteruskan ke tahap pemurnian selanjutnya dengan teknik kromatografi kolom tekan. Hasil akhir KKT didapat 7 fraksi gabungan (B1-B7) kemudian diuji alkaloidnya.

Berdasarkan hasil KLT dan uji alkaloid didapatkan fraksi B5 yang mengandung senyawa alkaloid dan memperlihatkan pola noda tunggal. Fraksi B5 sebanyak 19 mg berbentuk amorf berwarna hijau tua. Fraksi B5 yang dipilih untuk dianalisis, terlebih dahulu dilakukan uji kemurnian yang meliputi analisis KLT satu dan dua dimensi serta uji titik leleh. Analisis KLT satu dimensi dilakukan dengan menggunakan beberapa eluen, yaitu : n-heksana : etil asetat (8:2), n-heksana : aseton (7:3) dan kloroform 100%. Kromatogram KLT satu dimensi fraksi B5 ditunjukan pada Gambar 1.

Uji kemurnian dari fraksi B5 selanjutnya dilakukan dengan KLT dua dimensi mengguna-kan eluen n-heksana : etil asetat (8:2). Profil kromatogram fraksi B5 secara KLT dua dimensi ditunjukkan pada Gambar 2.

Berdasarkan Gambar 1 dan 2 dapat diketahui bahwa isolat dari fraksi B5 menampakkan noda berbentuk tunggal pada kromatogram. Bentuk noda tunggal tersebut menunjukan bahwa isolat B5 hasil isolasi relatif murni. Isolat B5 yang diperoleh berupa padatan amorf berwarna hijau tua dan mempunyai titik leleh 85-87 (tidak terkoreksi). Isolat B5 relatif murni yang didapat kemudian diteruskan ke tahap identifikasi. Isolat dianalisis dengan instrumen spektrofotometer UV-Vis, IM dan spektrometer RMI-1H dan RMI-13C. Spektrum UV isolat B5 memberikan serapan pada panjang gelombang 210, 220, 250, 270 dan 285 nm. Seperti terlihat pada Gambar 3.

Berdasarkan spektrum isolat B5 dikarakterisasi adanya puncak serapan pada panjang gelombang 210 nm yang merupakan kerangka dasar dari cincin furan yang dimiliki oleh alkaloid indol (Kong et al., 1985). Panjang gelombang 220 nm merupakan serapan maksimum untuk kromofor (C=C) aromatik. Adapun transisi yang terjadi adalah transisi  -  *. Serapan pada 270 nm menunjukan adanya serapan karbonil yang terjadi pada 270-300 nm. Puncak serapan pada λmaks 285 nm menunjukkan adanya kromofor benzena. Panjang gelombang maksimum sebesar 270 nm dan 285 nm mengindikasikan bahwa senyawa tersebut termasuk dalam golongan alkaloid indol. Menurut Nassel, 2008 terbentuknya dua buah serapan yang berdekatan menunjukkan ciri khas dari senyawa alkaloid indol. Spektrum IM isolat B5 memperlihatkan adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 3483 cm-1 (N-H), 3311 cm-1 (O-H), 2925 cm-1 (C-H), 1735 cm-1 (C=O), 1458 cm-1 (C=C), 1379 cm-1 (C-N), 1168 cm-1 (C–O) (Hart dkk., 2003). Spektrum IM isolat B5 dapat dilihat pada Gambar 4.

Data spektrum IM isolat B5 menunjukan bahwa terdapat gugus fungsi utama yaitu gugus amida (-CO-NR2) dan gugus metil (C-H). berdasarkan analisis spektrum IM maka dapat diasumsikan bahwa isolat B5 merupakan senyawa alkaloid, karena senyawa ini memiliki gugus fungsi NH pada strukturnya. Spektrum (RMI-1H) Isolat B5 menunjuk- an adanya sinyal triplet pada δH 0,89 (J= 3 Hz), sinyal multiplet pada δH 1,35 (J= 13 Hz), sinyal singlet pada δH 3,60 (J= 0,25 Hz), sinyal kuartet pada δH 3,98 (J= 1 Hz) dan sinyal singlet pada δH 8,14 (J= 0,1 Hz). Spektrum (RMI-1H) Isolat B5 dapat dilihat pada gambar 5.

Spektrum (RMI-13C) menunjukkan bahwa terdapat 14 sinyal karbon yang terdiri dari sinyal-sinyal untuk sebuah karbon kwarterner (C), tujuh buah karbon metin (CH), dua buah karbon metilen (CH2), dua buah karbon metil (CH3). Kemudian terdapat pula sinyal untuk CH-OH dan sebuah sinyal untuk C=O. Spektrum (RMI-13C) Isolat B5 dapat dilihat pada gambar 6.

Berdasarkan data spektrum UV dan IM dapat diperoleh asumsi awal bahwa isolat B5 merupakan senyawa alkaloid indol yang tersubstitusi pada cincin pirol. Keberadaan alkaloid pada isolat B5 juga diperkuat dengan adanya gugus amida yang memberikan serapan kuat pada bilangan gelombang 3483-3610 cm-1 untuk vibrasi ulur (N-H) (Hart dkk., 2003).

Puncak serapan pada λmaks 285 nm menunjukkan isolat B5 mengandung kromofor benzena. Posisi substitusi pada suatu cincin benzena dapat dilihat dari spektrum inframerahnya. Cincin-cincin benzena yang tersubstitusi mempunyai karakteristik absorpsi pada 680-900 cm-1 (Fessenden & Fessenden, 1986). Spektrum IM isolat B5 tidak menampakan adanya serapan pada rentang tersebut, sehingga dapat diduga bahwa senyawa alkaloid pada isolat B5 memiliki cincin benzen yang tidak tersubstitusi. Berdasarkan analisis tersebut maka diprediksi struktur dari isolat B5 adalah senyawa alkaloid Indol dengan struktur terlihat pada Gambar 7.

Permasalahan

Pada gamabar diatas diketahui adanya sinyal singlet, triplet dan kuartet. Manakah dari sinyal itu yang termasuk sinyal singlet, triplet dan kuarted?

Data spektrum IM isolat B5 (gambar diatas) menunjukan bahwa terdapat gugus fungsi utama yaitu gugus amida (-CO-NR2) dan gugus metil (C-H). pada gelombang mana yang menunjukkan gugus amida dan gugus metal itu ?