ISOLASI ALKALOID PADA KAFEIN

Alkaloid adalah senyawa organik mirip alkali yang mengandung atom nitrogen yang bersifat basa dalam cincin heterosiklik. Karena bersifat basa, tumbuhan yang mengandung alkaloid biasanya terasa pahit.  Dari segi biogenetik, alkaloid diketahui berasal dari sejumlah kecil asam amino yaitu ornitin dan lisin yang menurunkan alkaloid alisiklik, fenilalanin dan tirosin yang menurunkan alkaloid jenis isokuinolin, dan triftopan yang menurunkan alkaloid indol. Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa alkaloid adalah reaksi mannich antara suatu aldehida dan suatu amina primer dan sekunder, dan suatu senyawa enol atau fenol. Tipe alkaloid yang digunakan adalah kafein yang diekstraksi dari Camellia sinensis sinensis.

Kafein adalah sejenis senyawa alkaloid yang termasuk golongan metilxanthine (1,3,7-trimethylxantine). Efek psikologis yang dihasilkan dapat beragam dan bisa menyebabkan ketergantungan. Kafein cukup banyak terkandung dalam the (30-75 mg/cangkir), selain itu daun teh juga mengandung tannin dan sejumlah kecil klorofil. Struktur kafein terbangun dari system cincin purin, yang secara biologis penting dan diantaranya banyak ditemukan dalam asam nukleat.

Ekstraksi Padat-Cair

Ekstraksi padat cair yang dilakukan merupakan proses pemisahan kafein padat dari larutan. Pada tahap awal, daun C. sinensis sinensis diseduh dengan air mendidih. Hal ini dimaksudkan agar kelarutan kafein dalam air meningkat. Dalam hal ini, penambahan suhu berarti penambahan kalor yang meningkatkan energi kinetik campuran sehingga lebih mudah terjadi pelarutan. Dengan ini, diharapkan, kafein yang diekstrak dapat mencapai jumlah optimum.

Keberadaan tannin dalam C. sinensis sinensis menyebabkan penambahan natrium karbonat mejadi penting. Diklorometana digunakan untuk melarutkan kafein karena sebagai pelarut senyawa organik, diklorometana melarutkan kafein lebih baik (140 mg/mL) dari pada dalam air (22 mg/mL). Selain itu, tannin dalam bentuk garam juga tidak dapat larut dalam diklorometana sehingga kafein yang dihasilkan jauh lebih murni. Setelah corong pisah diguncang dan didiamkan, akan terbentuk dua fasa utama, yaitu fasa diklorometana dan fasa air. Karena kafein larut lebih baik dalam diklorometana dan tannin tidak larut di dalmnya, maka fasa yang diambil adalah fasa diklorometana. Keberadaan emulsi, seperti yang telah disebutkan, merupakan efek samping penggaraman tannin dan pengocokan yang terlalu kuat.

Tujuan penambahan CaCl₂ anhidrat adalah untuk pengikatan fasa air yang terikut sertakan pada pemisahan fasa diklorometan dan fasa air dengan menggunakan corong pisah (pengeringan). Fasa air bisa ikut serta karena dua hal. Pertama adalah karena ketidaksengajaan memasukkan fasa air atau emulsi. Kedua, adalah karena air sedikit larut dalam pelarut senyawa organik seperti diklorometan yang digunakan dalam praktikum ini. Kalsium klorida lebih banyak digunakan karena harganya lebih terjangkau. Namun, memiliki efek samping berikatan dengan senyawa oraganik yang mengandung oksigen sehingga terbentuk kompleks.

Setelah larutan ekstrak benar-benar bebas air, baru dilakukan distilasi. Pada praktikum ini digunakan distilasi sederhada karena diklorometan dan kafein memiliki titik didih yang jauh berbeda.

Pada tahap akhir, ditentukan dengan menggunakan melting block, titik leleh kafein  antara 196-198 ⁰C. Hal ini kurang bersesuaian dengan data literatur yang menyatakan bahwa titik didih kafein adalah sekitar 178 ⁰C. Ketidaksesuaian ini terjadi karena terdapat kontaminan lain dalam ekstrak yang memiliki titik leleh lebih tinggi. Selain itu, ekstrak juga belum benar-benar kering (masih mengandung diklorometan) karena tidak menggunakan penghisap vakum (ekstrak terlalu sedikit).

 Uji KLT

Pada kromatografi lapis tipis ini digunakan pelat alumunium dengan silika gel sebagai fasa diam dan pelarut organik, atau beberapa campuran pelarut organik sebagai fasa gerak. Ketika fasa gerak melalui permukaan silika gel, fasa gerak ini membawa analit organik melalui  partikel fasa diam. Namun, analit hanya bisa bergerak bersama pelarut jika tidak terikat pada permukaan silika gel.

Karakter elektropositif silika gel dan karakter elektronegatif oksigen membuat fasa diam silika gel sangatlah polar. Karena itu, semakin polar molekul yang akan dipisahkan, semakin kuat interaksinya dengan silika gel. Hal ini juga yang menyebabkan pemilihan pelarut non polar (diklorometan) pada percobaan ini. Pelarut nonpolar akan lebih lama berada pada fasa gerak dan jarak yang dapat ditempuhnya dapat dipastikan merupakan jarak terjauh dari kondisi awal sebelum dielusi. Karena itu, pembandingan Rf dari suatu zat yang kita cari dengan pelarut dapat dilakukan dengan baik.

Pemilihan jenis absorben sebagai fasa diam dan sistem pelarut sebagai fasa gerak haruslah dilakukan dengan tepat. Absorben dan pelarut harus dipilih sedemikian rupa agar terjadi kesetimbangan. Jika absorben mengikat semua molekul terlarut dengan kuat, maka senyawa-senyawa tersebut tidak akan turun keluar kolom. Sementara itu, jika pelarut mengikat semua molekul terlarut dengan kuat, maka senyawa-senyawa tersebut akan dengan mudah keluar dari kolom tanpa adanya pemisahan.

Penyemprotan dengan reagen dragendroff dan pengeringannya setelah proses elusi dimaksudkan untuk memberi warna pada zat organik yang kita dapat pada sampel. Hal ini perlu karena meskipun beberapa senyawa organik telah nampak berwarna, sebagian besar senyawa organik malah tidak memiliki warna dan memerlukan pewarnaan buatan untuk memudahkan pengamatan.

Selain berfungsi sebagai media analisis kualitatif, KLT juga memberikan gambaran kuantitatif kromatografik yang disebut Rf atau retardation factor atau ratio to front yang diekspresikan sebagai fraksi desimal. Secara matematis, Rf merupakan nilai perbandingan antara jarak tempuh zat dan jarak tempuh pelarut.

Berikut adalah tahapan dalam kromatografi lapis tipis ini.

1.         Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan ekstraksi, pewarna dari ekstrak akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk. Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

2.         Gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

3.         Perhitungan nilai Rf. Pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran dilakukan seperti pada gambar. Nilai R_f untuk setiap warna dihitung dengan rumus berikut.

R_f =    jarak yang ditempuh oleh komponen

           jarak yang ditempuh oleh pelarut

Semakin polar senyawa yang terkandung pada larutan, semakin kuat interaksinya dengan fasa diam yang digunakan, semakin kecil nilai Rf yang dihasilkannya.

Etil asetat dan kloroform berfungsi sebagai medium fasa bergerak larutan organik, dan metanol (senyawa alkohol) berfungsi sebagai medium fasa bergerak larutan polar atau air. Larutan organik akan terkapilarisasi bersama dengan pelarut organik etil asetat atau kloroform, sedangkan jika larutan bersifat polar maka akan terkapilaritasi bersama pelarut polar (metanol). Kafein yang merupakan senyawa organik akan terkapilaritasi bersama etil asetat dan kloroform.

Terdapat beda Rf yang dihasilkan elusi menggunakan etil asetat dan kloroform. Hal ini terjadi karena keduanya memiliki beda tingkat polaritas. Dengan Rf yang lebih kecil, etil asetat memiliki tingkat polaritas yang lebih tinggi dari kloroform. Namun, pada dasarnya uji KLT ini telah membuktikan keberadaan alkaloid jenis kafein dalam sampel.

Uji Alkaloid

Pengujian alkaloid menggunakan pereaksi meyer dan dragendroff pada dasarnya menggunakan sifat dasar alkaloid yang reaktif terhadap logam berat. Dalam hal ini, pereaksi meyer mengandung logam berat Bi (bismut) dan pereaksi dragendroff mengandung logam berat Pb (timbal). Bukti keberadaan alkaloid dalam sampel terutama dengan melihat keberadaan gumpalan atau endapan setelah terjadi reaksi antara sampel dan pereaksi meyer atau dragendroff. Pada pereaksi meyer, jika terdapat alkaloid, alakaloid akan bereaksi dengan bismut sehingga menggumpal dan mengendap dalam endapan berwarna kuning. Pada pereaksi dragendroff, jika terdapat alkaloid, alkaloid akan bereaksi dengan timbal sehingga menggumpal dan mengendap dalam endapan berwarna merah tua atau merah kecoklatan.

Hasil pengamatan dari percampuran ekstrak C. sinensis sinensis dengan kedua reagen menunjukkan tingginya kadar alkaloid yang terkandung di dalam ekstrak.. Pada reaksinya dengan reagen meyer, campuran nampak keruh dan terdapat endapat kuning. Selain itu, melihat reaksinya dengan reagen dragendroff yang menunjukkan adanya reaksi pengendapan, keberadaan sifat alkaloid pada ekstrak juga semakin bisa dipastikan. Berdasarkan sifat alakloid ini dapat ditentukan bahwa yang diekstrak memang benar merupakan alkaloid tipe kafein.

Biasanya, endapan lebih mudah muncul dengan reaksi antara sampel dengan dragendroff daripada dengan meyer. Kenapa begitu? Kemungkinan itu terjadi karena dibutuhkan lebih banyak alkaloid untuk menggumpalkan logam berat jenis bismut dari pada timbal.

Ekstraksi Cair-Cair

Dalam percobaan ini digunakan asam asetat glasial yang dititrasi dengan NaOH dan digunakan indikator fenolftalein. NaOH dan asam asetat akan membentuk garam natrium asetat. Garam tersebut dapat larut dalam air. Pada penambahan eter, larutan akan terfraksi ke dalam 2 fasa, yaitu fasa air dan fasa organik. Penambahan eter 1 x 15 ml menghasilkan jumlah asam asetat yang larut dalam fasa eter lebih sedikit daripada jika dilakukan penambahan eter 3 x 5 ml, meskipun jumlah total eter yang digunakan adalah sama. Hal ini terjadi karena jumlah kontak dan probabilitas pelarutan asam asetat dalam eter menjadi lebih tinggi. Hal yang sebaliknya terjadi pada fasa air.

Permasalahan

Dari artikel diatas, dalam ekstraksi padat-cair, di dalam daun C. sinensis sinensis terdapat tannin dan kafein. Mengapa digunakan juga diklorometana dalam ekstraksi ini padahal kita tau tannin bersifat larut dalam air dan diklorometana? Bagaimana caranya agar kafein yang kita peroleh dari daun C. sintesis sintesis  lebih murni padahal yang kita tau dalam daun C. sintesis sintesis  bukan hanya ada kafein, tetapi juga ada tannin.?